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更新時間:2019年11月26日

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白頭翁皂苷抗腫瘤作用及機制研究.caj
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2015138期大乐透区间选号推荐 www.whfwa.tw電子書 癌癥是危害人類生命健康的嚴重疾病之一,發病率逐年上升,尋找惡性腫瘤有效的防治方法迫在眉睫?;б┪鎦瘟剖塹苯裰瘟浦琢齙鬧饕侄沃?但化療藥物在作用于靶細胞時往往累及正常細胞,產生免疫功能低下、骨髓抑制、臟器受損等毒副作用,嚴重的副作用和多藥耐藥等問題使其應用受到很大的限制。中藥具有多成分、多靶點的作用特點,可作用于腫瘤發病的不同環節,同時其毒副作用低,能提高機體免疫力,不易產生耐藥性,因此,中藥及其活性成分成為近年來抗腫瘤藥物研究的熱點。常用于治療腫瘤的中藥有清熱解毒藥、補益類藥、活血化瘀藥、利水滲濕健脾類藥,其中以藥性寒涼的清熱解毒藥所占的比例最大。

白頭翁皂苷抗腫瘤作用及機制研究作  者 : 羅穎穎學位授予單位 :  湖南中醫藥大學學位名稱 : 博士導師姓名 : 郭建生;陳蘭英學位年度 : 2014關鍵詞 : 白頭翁皂苷;腫瘤;凋亡;自噬;能量代謝;多成分
摘  要 : 癌癥是危害人類生命健康的嚴重疾病之一,發病率逐年上升,尋找惡性腫瘤有效的防治方法迫在眉睫?;б┪鎦瘟剖塹苯裰瘟浦琢齙鬧饕侄沃?但化療藥物在作用于靶細胞時往往累及正常細胞,產生免疫功能低下、骨髓抑制、臟器受損等毒副作用,嚴重的副作用和多藥耐藥等問題使其應用受到很大的限制。中藥具有多成分、多靶點的作用特點,可作用于腫瘤發病的不同環節,同時其毒副作用低,能提高機體免疫力,不易產生耐藥性,因此,中藥及其活性成分成為近年來抗腫瘤藥物研究的熱點。常用于治療腫瘤的中藥有清熱解毒藥、補益類藥、活血化瘀藥、利水滲濕健脾類藥,其中以藥性寒涼的清熱解毒藥所占的比例最大。白頭翁屬清熱解毒類中藥,本課題組前期從白頭翁藥材中提取得到白頭翁皂苷(多成分)后,進行體內外抗腫瘤藥效實驗確定其為白頭翁抗腫瘤的有效部位(總皂苷可測得成分含量達90%以上,所含皂苷成分量達75%左右),并進一步對總皂苷中主要成分進行了分離鑒定及體外抗腫瘤活性篩選和構效關系研究,目前確定了具有抗腫瘤活性的有效成分為B3、B7、B9、B11等,本課題在此基礎上,進行系統的白頭翁皂苷抗腫瘤作用藥效學研究及抗腫瘤作用機制研究,為白頭翁抗腫瘤新藥開發及其臨床應用提供堅實的理論基礎。目的在前期研究基礎上,進行系統的白頭翁皂苷抗腫瘤作用藥效研究,并從誘導腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤細胞自噬、調節腫瘤細胞能量代謝等方面出發,進行白頭翁皂苷極其中有效成分B3、B7等抗腫瘤作用機制研究,以期通過對白頭翁皂苷中的多成分(B3、B7等)抗腫瘤作用機制研究,闡明白頭翁皂苷抗腫瘤作用是否通過多靶點協同整合調節而產生的,從而科學詮釋白頭翁皂苷的多成分,多途徑,多機制的抗腫瘤作用,為白頭翁抗腫瘤新藥開發及其臨床應用提供堅實的理論基礎。方法第一部分白頭翁中抗腫瘤有效部位及有效成分的確定通過體外培養人肝癌Bel-7402、SMMC-7721細胞及人結腸癌HT-29、HCT-116細胞;體內建立H22肝癌小鼠移植瘤模型,進行白頭翁皂苷體內外抗腫瘤作用藥效確定;通過體外培養人肝癌細胞SMMC-7721,人結腸癌細胞HT29;體內建立H22肝癌小鼠移植瘤模型,進行白頭翁皂苷中有效成分B3、B7、B9、B11體內外抗腫瘤作用藥效篩選。第二部分白頭翁皂苷抗腫瘤藥效作用研究1.白頭翁皂苷體外抗腫瘤作用研究體外培養BGC-823、SGC-7901、NCI-H460、A549、SMMC-7721、Bel-7402、HT-29、HCT116、U251、SK-0V-3、PC-3及K562共12種腫瘤細胞株,采用MTT法檢測白頭翁皂苷對腫瘤細胞的增殖抑制率,并計算半效抑制濃度IC50(μg/ml).2.白頭翁皂苷抗CT26. WT結腸癌、H22肝癌小鼠移植瘤藥效實驗分別用CT26.WT結腸癌細胞、H22肝癌腹水接種至BALB/c小鼠和KM小鼠右側腋窩皮下建立CT26. WT結腸癌、H22肝癌動物移植瘤模型,給藥14天,取瘤,稱量瘤重計算抑瘤率(%),觀察白頭翁皂苷對各移植瘤的影響;取動物胸腺、脾臟,稱重,計算各組動物臟器指數;取外周血,全自動血球儀檢測血細胞情況,觀察白頭翁皂苷對小鼠血細胞的影響。3.白頭翁皂苷抗人癌裸鼠異體移植瘤藥效實驗分別用人結腸癌HT29、人肝癌Bel-7402細胞裸鼠移植成瘤,再經裸鼠傳代2代以上的瘤塊,采用套管針接種于裸鼠腋部皮下,建立人結腸癌/肝癌裸鼠異體移植瘤模型。給藥24天左右,測量瘤體積,1次/3d,末次給藥后取瘤,稱量瘤重計算抑瘤率(%),觀察白頭翁皂苷對各移植瘤的影響;取動物肝臟、脾臟,稱重,計算各組動物臟器指數;取外周血,全自動血球儀檢測血細胞情況,觀察白頭翁皂苷對小鼠血細胞的影響。第三部分白頭翁皂苷抗腫瘤作用機制研究1.白頭翁皂苷誘導腫瘤細胞凋亡作用研究通過體外培養人HT29結腸癌細胞,白頭翁皂苷干預48hr后,采用DAPI染色,倒置熒光顯微鏡觀察細胞凋亡形態;AnnexinV/PI雙染,流式細胞術觀察白頭翁皂苷對HT29細胞凋亡率的影響。2.白頭翁皂苷誘導腫瘤細胞自噬作用研究通過體外培養人HT29結腸癌細胞,白頭翁皂苷干預48hr后,采用免疫熒光染色,觀察自噬標志蛋白LC3的表達及分布;采用Western blotting檢測LC3蛋白表達,白頭翁皂苷對HT29細胞自噬發生的影響。3.白頭翁皂苷調節腫瘤細胞能量代謝作用的研究通過建立人Bel-7402肝癌裸鼠異體移植瘤模型,白頭翁皂苷干預后,采用生物化學檢測法觀察白頭翁皂苷對瘤塊組織中乳酸和ATP水平的變化;采用比色法和ELISA法觀察白頭翁皂苷對瘤塊組織己糖激酶Ⅱ(HK Ⅱ)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)及琥珀酸脫氫酶含量的影響。4.白頭翁皂苷中有效成分抗腫瘤作用機制研究通過體外培養通過體外培養人HT29結腸癌細胞,B3、B7干預48hr后,采用流式細胞術檢測觀察B3、B7對細胞凋亡作用的影響;采用免疫熒光染色和Westernblotting觀察B3、B7對自噬凋亡蛋白LC3的影響;采用生物化學檢測法觀察B3、B7對培養上清中乳酸和葡萄糖含量的影響。5.基于Akt通路白頭翁皂苷及其有效成分抗腫瘤作用的分子機制研究通過體外培養通過體外培養人HT29結腸癌細胞,白頭翁皂苷、B3、B7干預48hr后,各受試藥物對Akt通路以Akt通路為主線,選擇其下游與凋亡、自噬及能量代謝相關的路徑成員F0X01, Bim, Caspase9, Bcl-2,Bax,Caspase3, Atgl, Atgl3, Beclinl, PI3K Ⅲ, p70s6k, Bad, GSK-3GLUT1, HIFα為目標基因,采用PCR芯片檢測,觀察白頭翁皂苷、B3及B7對其的影響,以期闡明白頭翁皂苷多成分、多靶點的作用特點。結果第一部分白頭翁中抗腫瘤有效部位及有效成分的確定結果表明,白頭翁皂苷體外對人肝癌細胞Bel-7402、SMMC-7721有較好的抑制作用,在25μg/ml抑制率可達100%,IC50值分別為5.12、2.26μg/ml,對人結腸癌HT29、HCT-116亦有較好的抑制作用,IC50值分別為2.03,3.24μg/ml,具有較好的體外抗腫瘤活性;對小鼠H22肝癌移植瘤模型的抑瘤率可達67.5%,抗腫瘤活性顯著。進一步的白頭翁皂苷中有效成分的藥效篩選結果顯示,B3、B7、B9、B11體外具有較好的抗腫瘤活性,與白頭翁皂苷活性相當;各單體體內對小鼠H22肝癌移植瘤模型亦有一定的抑制作用。第二部分白頭翁皂苷抗腫瘤藥效作用研究1.白頭翁皂苷體外抗腫瘤作用研究體外抗腫瘤實驗表明,白頭翁皂苷對受試的12種腫瘤細胞株均有很好的抑制作用,在濃度為25μg/ml時,對12個細胞株的增殖抑制率均在96%以上,且呈具有良好的劑量依賴關系。對12個腫瘤細胞株的IC50均值范圍為:3.44-9.91μg/ml,具有顯著的體外抗腫瘤活性。2.白頭翁皂苷抗CT26.WT結腸癌、H22肝癌小鼠移植瘤藥效實驗動物移植瘤實驗表明,白頭翁皂苷高、中、低劑量(300,200,100mg/kg)組對H22抑瘤率分別為74.37%、61.59%、54.6%;對CT26. WT小鼠結腸癌抑瘤率分別為67.9%,51.35%,22.03%;對動物體重、脾臟有一定的影響,但對動物白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板等均無明顯影響。3.白頭翁皂苷抗人癌裸鼠異體移植瘤藥效實驗人癌裸鼠異體移植瘤實驗結果表明,白頭翁皂苷對Bel-7402肝癌的抑制率高、中、低劑量組分別為42.8%、31.5%、14.9%;對HT29結腸癌抑瘤率高、中、低劑量組依次為30.9%、23.5%、17.8%,具有較好的體內抗腫瘤作用,對動物體重、脾臟有一定的影響,但對動物白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板等均無明顯影響,第三部分白頭翁皂苷抗腫瘤作用機制研究1.白頭翁皂苷誘導腫瘤細胞凋亡作用研究白頭翁皂苷干預48h后,HT29細胞凝縮變亮的細胞核較多;流式細胞儀檢測細胞凋亡率有所增加,其中10、15、20μ g·mL-1與空白組相比明顯增加,具有顯著性差異(P<0.05),且呈現一定得劑量依賴關系,表明白頭翁皂苷可以誘導HT29細胞凋亡。2.白頭翁皂苷誘導腫瘤細胞自噬作用研究由染色結果看出,未經白頭翁干預的空白組HT29細胞LC3蛋白在胞質內分布均勻。白頭翁皂苷干預后,可能促進了自噬蛋白LC3的活化及降解,出現了碎斑塊樣的自噬小體;Westernblotting檢測結果表明,白頭翁皂苷干預后,胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)分解成(自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ),表明白頭翁皂苷可誘導HT29細胞自噬。3.白頭翁皂苷調節腫瘤細胞能量代謝作用的研究生物化學檢測法顯示白頭翁皂苷能明顯降低瘤塊組織中乳酸和ATP的含量;ELISA結果顯示白頭翁皂苷可降低糖酵解關鍵酶己糖激酶Ⅱ(HK Ⅱ)、磷酸果糖激酶(PFK)及丙酮酸激酶(PK)的含量,提高三羧酸循環關鍵酶琥珀酸脫氫酶(SDH)的含量,說明白頭翁皂苷可以調節腫瘤細胞能量代謝。4.白頭翁皂苷中有效成分抗腫瘤作用機制研究結果表明,與空白對照相比,B3/B7均能誘導腫瘤細胞發生凋亡,除B3低劑量2.5μg/ml外,其余各給藥組細胞凋亡率與對照組比較有顯著性差異;與空白對照組相比,B3、B7各濃度給藥組細胞均表達LC3-Ⅱ,且隨著濃度的升高而增多;B3、B7能減少HT29細胞葡萄糖的攝取和乳酸的形成。5.基于Akt通路白頭翁皂苷及其有效成分抗腫瘤作用的分子機制研究結果表明,與對照組相比,白頭翁皂苷組Akt、Caspase9、Caspase3、 GLUT1基因表達明顯下調(P<0.05-P<0.001),Atgl基因表達明顯上調(P<0.01), Bim和Beclinl基因表達有上調趨勢;B3組Akt、Caspase9、 Atgl3基因表達明顯下調(P<0.05-P<0.01);B7組Akt、Caspase9、 Caspase3、Atgl3、 GLUT1基因表達明顯下調(P<0.05-P<0.01),Bim和Beclinl基因表達明顯上調(P<0.05)。與白頭翁皂苷組比較,B3組Caspase9、Caspase3、GLUT1基因表達明顯上調(P<0.05-P<0.001)、Atgl基因表達明顯下調(P<0.05);B7組Caspase9、Caspase3基因表達明顯上調(P<0.05-P<0.01), Atgl3、Atgl基因表達明顯下調(P<0.05),說明針對Caspase9、Caspase3、GLUT1、Atgl這些靶基因,白頭翁皂苷作用要強于有效成分B3和B7。進一步的蛋白驗證結果表明,白頭翁皂苷、B3、B7能明顯下調pAkt、HIF-α蛋白表達、上調Cleave-Caspase3的蛋白表達。結論1.白頭翁皂苷體內外均具有良好的抗腫瘤活性,體外對12種腫瘤細胞的IC50范圍在3.44-9.91μg/ml;體內對H22肝癌、CT26.WT結腸癌小鼠移植瘤及人肝癌Bel-7402及結腸癌HT29裸鼠異體移植瘤均具有良好的抑制作用,且對白細胞無明顯影響。2.白頭翁皂苷通過調控Akt蛋白及其相關路徑成員,進而誘導腫瘤細胞凋亡、自噬,調節腫瘤細胞能量代謝發揮抗腫瘤作用;而其有效成分B3、B7均可誘導腫瘤細胞凋亡、自噬,調節腫瘤細胞能量代謝,由此說明,白頭翁皂苷抗腫瘤作用可能通過其B3、B7等成分共同作用而產生。
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